Eine Krebszelle unter dem Mikroskop im Vergleich (Abbildung: APH, kit.edu)

Karlsruhe (pte033/31.01.2017/13:30) –

Forscher am Karlsruher Institut für Technologie http://kit.edu haben die Fluoreszenzmikroskopie erweitert. Die STEDD-Nanoskopie
("Stimulated Emission Double Depletion") liefert nicht nur
höchstaufgelöste Bilder, sondern unterdrückt auch den Untergrund. Daraus
ergibt sich eine deutlich bessere Bildqualität, von der besonders die
Analyse dreidimensional dicht angeordneter subzellulärer Strukturen
profitiert.

STEDD statt STED

Die KIT-Experten haben die bereits bestehende
STED-Nanoskopie so erweitert, dass sich der in den Bildern stets
vorhandene Untergrund durch eine modifizierte Bildaufnahme effizient
unterdrücken lässt. Die Bildqualität ist dadurch deutlich besser, was
vor allem für die quantitative Datenanalyse von dreidimensional dicht
angeordneten Molekülen und Zellstrukturen von großem Vorteil ist.

Bei der Fluoreszenzmikroskopie wird die zu
untersuchende Probe mit einem stark fokussierten Lichtstrahl
abgerastert, um Farbstoffmoleküle zur Aussendung von Fluoreszenzlicht
anzuregen. Die Lichtquanten werden Pixel für Pixel registriert und so
das Bild aufgebaut. Bei der STED-Nanoskopie wird der zum Abrastern
verwendete Anregungsstrahl von einem weiteren Strahl überlappt, dem
sogenannten STED-Strahl. Dessen Lichtintensität liegt ringförmig um den
Anregungsstrahl herum; im Zentrum ist sie null. Außerdem ist der
STED-Strahl zu größeren Wellenlängen hin verschoben.

Der STED-Strahl nutzt einen von Albert Einstein vor 100
Jahren erstmals beschriebenen physikalischen Effekt, die stimulierte
Emission, um die Fluoreszenzanregung überall abzuschalten – außer im
Zentrum, wo der STED-Strahl keine Intensität besitzt. Dadurch wird die
Anregung eingeschnürt, und es entsteht ein schärferer Lichtfleck für die
Rasterung. Allerdings gibt es in dem hochaufgelösten STED-Bild stets
einen niedrig aufgelösten Untergrund, der zum einen durch
unvollständiges Abschalten, zum anderen durch Fluoreszenzanregung durch
den STED-Strahl selbst verursacht wird.

Zwei Bilder aufgenommen

Die Forschergruppe um Professor Gerd Ulrich Nienhaus
hat die STED-Methode um einen zweiten STED-Strahl erweitert. Dieser
STED2-Strahl folgt dem STED-Strahl zeitverzögert und löscht das im
Zentrum vorhandene Nutzsignal aus, sodass nur noch die
Untergrundanregung übrig bleibt. "Beim STEDD-Verfahren werden zwei
Bilder aufgenommen", erklärt Nienhaus.

Zum ersten und zum zweiten Bild tragen jeweils Photonen
bei, die vor beziehungsweise nach dem Eintreffen des STED2-Strahls
registriert werden. Durch Differenzbildung werde das zweite Bild, das
nur Untergrund enthält, vom ersten Bild, das Nutzsignal plus Untergrund
enthält, Pixel für Pixel abgezogen – es entsteht ein höchstaufgelöstes,
untergrundfreies Bild.